La citometría de flujo ha transformado profundamente la investigación en ciencias vegetales, convirtiéndose en una herramienta indispensable para el estudio del genoma, la evolución y el mejoramiento genético de las plantas. Lo que comenzó como una tecnología desarrollada para aplicaciones biomédicas es hoy una plataforma de alto rendimiento capaz de analizar miles de núcleos por segundo, proporcionando información precisa sobre el contenido de ADN, el nivel de ploidía y la organización cromosómica. Más recientemente, la incorporación de sistemas de sorting celular ha permitido aislar cromosomas individuales para estudios avanzados de genómica, secuenciación y clonación de genes, abriendo nuevas oportunidades para la investigación agrícola y biotecnológica (Greilhuber et al., 2007).
De la biomedicina a las ciencias vegetales
Aunque los primeros experimentos de citometría de flujo en plantas se realizaron durante la década de 1970, la técnica adquirió verdadero impulso con el método desarrollado por Galbraith y colaboradores en 1983 (Greilhuber et al., 2007).
El principal obstáculo para aplicar la citometría de flujo en plantas era la presencia de una pared celular rígida compuesta por celulosa, hemicelulosas y pectinas, que impedía obtener suspensiones de células individuales de manera sencilla, como ocurre en tejidos animales. En los primeros estudios era necesario eliminar enzimáticamente la pared celular para producir protoplastos o recurrir a procedimientos laboriosos de aislamiento nuclear, procesos que consumían mucho tiempo, requerían reactivos costosos y podían afectar la calidad de la muestra (Greilhuber et al., 2007).
El método propuesto por Galbraith revolucionó este campo al demostrar que bastaba con fragmentar mecánicamente hojas frescas con una cuchilla en un buffer de aislamiento que contenía detergentes suaves para liberar núcleos intactos, los cuales podían filtrarse y analizarse directamente por citometría de flujo. Esta estrategia simplificó drásticamente la preparación de muestras, mejoró la reproducibilidad de los análisis y permitió que la citometría de flujo se convirtiera en una técnica rutinaria para el estudio del contenido de ADN y del tamaño del genoma en plantas (Greilhuber et al., 2007).
Actualmente, la técnica ofrece numerosas ventajas frente a otros métodos. Dentro de las ventajas se tiene que la preparación de muestras es rápida, el análisis puede realizarse sobre miles de núcleos en pocos segundos y la precisión aumenta considerablemente gracias al elevado número de eventos adquiridos. Además, al analizar automáticamente toda la población nuclear, se reduce el sesgo asociado con la selección manual de núcleos observados al microscopio (Greilhuber et al., 2007).
Fundamentos del análisis del contenido de ADN
En las plantas, la citometría de flujo se utiliza principalmente para cuantificar el contenido de ADN nuclear mediante la medición de la fluorescencia emitida por fluorocromos que se unen al ADN. Durante el análisis, los núcleos aislados de las células vegetales pasan individualmente por el haz del láser del citómetro y la intensidad de fluorescencia registrada es directamente proporcional a la cantidad de ADN presente. Esta información permite calcular el tamaño del genoma de una especie, comparar poblaciones y detectar variaciones genéticas de forma rápida y reproducible (Bourge et al., 2018).
La estimación del tamaño del genoma constituye una de las aplicaciones más difundidas de la citometría de flujo vegetal. Para ello, los núcleos de la muestra y de una especie estándar con tamaño genómico conocido se aíslan y analizan simultáneamente. La relación entre la intensidad de fluorescencia de ambos permite calcular con precisión el contenido de ADN de la especie estudiada. Esta información es fundamental para identificar eventos de poliploidía, procesos de hibridación, variabilidad intraespecífica y relaciones evolutivas entre especies (Bourge et al., 2018).
La selección del fluorocromo influye directamente en la calidad del análisis. El yoduro de propidio (PI) es considerado el estándar para la cuantificación absoluta del ADN debido a su unión estequiométrica al ADN, mientras que fluorocromos como DAPI o Hoechst presentan afinidad preferencial por regiones ricas en adenina y timina y son especialmente útiles para aplicaciones citogenéticas específicas. Cuando se emplea PI es recomendable incorporar RNasa para evitar la interferencia del ARN en la medición de la fluorescencia (Bourge et al., 2018).
Además del tamaño del genoma, la citometría de flujo permite estudiar el ciclo celular, cuantificar fenómenos de endorreduplicación, analizar la composición relativa de bases AT/GC y evaluar semillas, tejidos y poblaciones completas dentro de programas de mejoramiento genético y conservación de recursos fitogenéticos (Bourge et al., 2018).
Preparación de muestras: un paso determinante
La calidad del análisis depende en gran medida de la preparación de la muestra. En la mayoría de las especies se prefieren hojas completamente desarrolladas, ya que contienen menor cantidad de metabolitos que interfieren con la tinción del ADN. Sin embargo, dependiendo de la especie, también pueden emplearse raíces, tallos o semillas cuando ofrecen mejores histogramas. El tejido seleccionado se fragmenta mecánicamente en un buffer especial de aislamiento nuclear, se filtra para eliminar residuos celulares y posteriormente los núcleos se tiñen con un fluorocromo apropiado antes de su análisis (Bourge et al., 2018).
Un aspecto particularmente importante en plantas es la presencia de metabolitos secundarios como fenoles, taninos, mucílagos y antocianinas, los cuales pueden inhibir la unión del fluorocromo al ADN y alterar la posición de los picos de fluorescencia. Por esta razón, la selección del tejido y del buffer de aislamiento resulta crítica para obtener resultados reproducibles (Greilhuber et al., 2007).
Citogenética de flujo y sorting de cromosomas
Más allá del análisis de núcleos, la citometría de flujo ha dado origen a la citogenética de flujo, disciplina que analiza cromosomas mitóticos individuales en suspensión. Durante el proceso, los cromosomas individuales atraviesan el láser, permitiendo registrar parámetros de fluorescencia y dispersión de luz para construir un “cariotipo de flujo”. Cuando el instrumento dispone de la capacidad de sortear, es posible separar cromosomas específicos con alta pureza para estudios posteriores (Doležel et al., 2023).
La preparación de cromosomas sigue el protocolo clásico desarrollado por Doležel et al. (1992), que comienza con la germinación de semillas y el crecimiento de raíces jóvenes. Posteriormente, las células se sincronizan en metafase mediante inhibidores del ciclo celular, se fijan cuidadosamente y los cromosomas se liberan mediante homogenización mecánica antes de su tinción y análisis por citometría de flujo. Este método, descrito y optimizado posteriormente por Doležel et al. (2023), ha permitido obtener suspensiones cromosómicas de alta calidad en numerosas especies vegetales, especialmente en cereales de importancia agrícola.
El aislamiento de cromosomas individuales ha revolucionado la investigación genómica. Los cromosomas obtenidos mediante sorting (Figura 1) pueden emplearse para construir bibliotecas cromosómicas, desarrollar marcadores moleculares, secuenciar regiones específicas del genoma, proteómica y clonar genes asociados con características agronómicas de interés. Este enfoque reduce considerablemente la complejidad de trabajar con genomas grandes y altamente repetitivos, facilitando análisis más rápidos, precisos y económicos (Doležel et al., 2023).
Figura 1. Esquema simplificado de un citómetro de flujo con capacidad de separación celular (sorting). Un instrumento de este tipo puede separar simultáneamente dos cromosomas diferentes. El ejemplo muestra el análisis y la separación de cromosomas de una especie hipotética con 2n = 8, en la cual todos los cromosomas difieren en tamaño y, por lo tanto, en su contenido de ADN. Cada uno de los cuatro cromosomas está representado por un único pico en el cariotipo de flujo (Flow karyotype en la figura). Un cariotipo de flujo es una distribución del contenido relativo de ADN de los cromosomas, donde el eje “x” representa el contenido relativo de ADN y el eje “y”, el número de eventos. El ejemplo muestra la separación de los cromosomas 1 y 3 mediante sus respectivas ventanas de separación, R2 y R1, indicadas en el cariotipo de flujo (Adaptado de Greilhuber et al., 2007).
En Diagnostika entendemos que la citometría de flujo es una herramienta con una utilidad que va más allá de las aplicaciones biomédicas. Las plataformas modernas de análisis y de sorting celular ofrecen un enorme potencial para la investigación en genética, citogenética, biología molecular y biotecnología vegetal. Nuestro compromiso es proporcionar soluciones tecnológicas de alto desempeño, acompañadas de asesoría científica, que permitan a universidades, centros de investigación y laboratorios agrícolas aprovechar al máximo esta poderosa tecnología.
Referencias Bibliográficas
- Bourge, M., Brown, S. C., & Siljak-Yakovlev, S. (2018). Flow cytometry as tool in plant sciences, with emphasis on genome size and ploidy level assessment. Genetics & Applications, 2(2), 1–12. https://doi.org/10.31383/ga.vol2iss2pp1-12.
- Doležel, J., Číhalíková, J., & Lucretti, S. (1992). A high-yield procedure for isolation of metaphase chromosomes from root tips of Vicia faba L. Planta, 188, 93–98.
- Doležel, J., Lucretti, S., Molnár, I., Cápal, P., & Giorgi, D. (2021). Chromosome analysis and sorting. Cytometry Part A, 99(4), 328–342. https://doi.org/10.1002/cyto.a.24324.
- Doležel, J., Urbiš, P., Said, M., Lucretti, S., & Molnár, I. (2023). Flow cytometric analysis and sorting of plant chromosomes. The Nucleus, 66, 355–369. https://doi.org/10.1007/s13237-023-00450-6
- Greilhuber, J., Temsch, E. M., & Loureiro, J. C. M. (2007). Nuclear DNA content measurement. En J. Doležel, J. Greilhuber, & J. Suda (Eds.), Flow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes (pp. 67–101). Wiley-VCH.
