BD Biosciences ofrece una variedad de herramientas para ayudar a los investigadores a comprender mejor los mecanismos celulares fundamentales involucrados en la inmunidad, inflamación, hematopoyesis, neoplasia y otras respuestas biológicas. Entre estas herramientas se incluyen anticuerpos, kits y sistemas para medir las respuestas proliferativas bajo diversas condiciones. Mediante el uso de citometría de flujo, los investigadores pueden evaluar de manera rápida y precisa el estado del ciclo celular en células dentro de poblaciones en proliferación (BD Biosciences, 2015).
La proliferación celular se refiere al aumento en el número de células como resultado de su crecimiento y división. El equilibrio entre la proliferación celular y la apoptosis es importante tanto para el desarrollo como para la homeostasis normal de los tejidos (BD Biosciences, 2014). En investigaciones relacionadas con el cáncer, los ensayos de proliferación celular tienen diversas aplicaciones como en ensayos de citotoxicidad, expansión de células CAR-T, desarrollo de fármacos y determinación de la inhibición del crecimiento tumoral (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2020).
El crecimiento, la replicación y la división celular en las células eucariotas ocurren según una serie de eventos altamente controlados denominada ciclo celular. Este tiene dos fases principales: la interfase, que es la fase donde la célula crece y duplica su ADN y se prepara para la división, y la fase mitótica, donde la célula madre se divide en dos células hijas genéticamente idénticas. La interfase consta de tres etapas sucesivas y distintas. Durante la primera etapa, llamada G1, las células “monitorean” su entorno, y cuando reciben las señales necesarias, las células sintetizan ARN y proteínas para inducir el crecimiento. Cuando las condiciones son las adecuadas, las células entran en la fase S del ciclo celular y se “comprometen” con la síntesis de ADN, replicando su ADN cromosómico. Finalmente, en la fase G2, las células continúan creciendo y se preparan para la mitosis (BD Biosciences, 2015).
Durante las fases del ciclo celular, los niveles de ADN varían, lo que facilita el uso de tintes intercalantes de ADN como el 7-Amino-Actinomicina (7-AAD), yoduro de propidio (PI), Hoescht y DAPI, para generar perfiles característicos del contenido de ADN celular. BD Biosciences ofrece una amplia variedad de reactivos para el estudio contenido de ADN, incluido el kit BD Cycletest™ Plus DNA, que permite medir con precisión el ADN mediante citometría de flujo, facilitando la evaluación en menos tiempo de la ploidía celular y la estimación del índice de ADN de las células (BD Biosciences, 2015).
Kits de proliferación celular
Los tintes de proliferación celular BD Horizon™ son moléculas no fluorescentes que se difunden pasivamente dentro de las células. Una vez dentro, son hidrolizadas por esterasas intracelulares no específicas para convertirse en productos fluorescentes. Después de la hidrólisis, el tinte queda atrapado dentro de la célula (Figura 1) (BD Biosciences, 2014).
- El tinte BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450 (VPD450) se excita con el láser violeta y emite a 450 nm (canal V450).
- El BD Horizon™ CFSE se excita con el láser azul y emite a 521 nm (canal FITC). Estos reactivos permiten flexibilidad en el diseño de paneles multicolores.
Las células estimuladas que contienen el tinte de proliferación celular BD Horizon™ se dividirán y formarán nuevas generaciones de células. Cada nueva población tendrá aproximadamente la mitad de la intensidad de fluorescencia de la división anterior. Estas divisiones pueden ser contadas mostrando un histograma de fluorescencia, donde cada pico corresponde a una generación separada de división celular. Combinar las generaciones celulares con marcadores específicos de la superficie celular e intracelulares permite determinar los momentos clave de los eventos que ocurren en los sistemas experimentales (BD Biosciences, 2014).
Figura 1. Los tintes de proliferación celular BD Horizon™ entran libremente en la célula. Una vez dentro de la célula, los tintes son descompuestos por esterasas no específicas y liberan una molécula fluorescente, la cual queda atrapada dentro de la célula.
Kit de análisis del contenido de ADN
El kit BD Cycletest™ Plus DNA proporciona un kit de reactivos para aislar y teñir núcleos celulares provenientes de muestras de tejido sólido (fresco o congelado) o de suspensiones celulares, con el objetivo de analizar su ADN, incluyendo la ploidía y el ciclo celular, mediante citometría de flujo. Este kit es compatible con análisis de tejidos sólidos o de células en suspensión de modelos experimentales in vivo o in vitro (BD Biosciences, 2012).
El método implica disolver los lípidos de la membrana celular con un detergente no iónico, eliminar el citoesqueleto celular y las proteínas nucleares con tripsina, digerir el ARN celular con una ribonucleasa A específica y estabilizar la cromatina nuclear con espermina. El yoduro de propidio se une estequiométricamente al ADN, y los núcleos teñidos se analizan posteriormente en un citómetro de flujo para cuantificar el PI unido al ADN (BD Biosciences, 2015).
En el histograma de fluorescencia de PI, las células diploides (2N) y tetraploides (4N) se pueden identificar por las intensidades medias de fluorescencia (MFI) de sus picos (Figura 2). Las células diploides en la fase temprana del ciclo celular (G0/G1) contienen la mitad de la cantidad de ADN y, por lo tanto, la mitad de la fluorescencia de las células tetraploides que se están preparando para la mitosis (G2/M). Para determinar la aneuploidía de las células anormales, las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) pueden teñirse simultáneamente como referencia de la población normal. El índice de ADN (DI) se puede calcular como la relación de MFI de la población anormal de G0/G1 con la población normal de G0/G1(BD Biosciences, 2012).
Un ejemplo de este tipo de histograma se muestra en la Figura 2, donde las células de la leucemia K562 fueron cultivadas, y teñidas con el kit de reactivos BD Cycletest Plus DNA, y posteriormente adquiridas y analizadas en el equipo BD Accuri C6. En el histograma de PI de las células K562 se distingue a las células en las fases G0/G1, S y G2+M del ciclo celular (BD Biosciences, 2012).
En el ámbito clínico, el análisis del nivel de ploidía se realiza usualmente con el kit de reactivos Cycloscope de BD Cytognos, el cual aporta información relevante para la evaluación pronóstica y el seguimiento de pacientes con tumores sólidos y/o neoplasias hematológicas. De manera similar, los estudios del ciclo celular en células tumorales tienen gran importancia clínica y diagnóstica. La presencia de una elevada proporción de células en fase S está asociada con características clínicas que indican un mal pronóstico, tanto en tumores sólidos como en neoplasias hematológicas (Cytognos, 2022).
Figura 2. Análisis del ciclo celular y la ploidía con el kit de reactivos BD Cycletest™ Plus DNA.
Referencias Bibliográficas
- BD Biosciences. (2012). BD Cycletest™ Plus DNA Reagent Kit: DNA analysis on the BD Accuri™ C6 Flow Cytometer. BD Biosciences.
- BD Biosciences. (2014). BD Horizon™ Cell Proliferation Dyes. BD Biosciences.
- BD Biosciences. (2015). BD Cycletest™ Plus DNA Kit: For the analysis of nuclear DNA from solid tissue or cell suspensions. BD Biosciences.
- BD Biosciences. (2015). Tools for Assessing Cell Events: Apoptosis, Cell Cycle, and Cell Proliferation. BD Biosciences.
- Cytognos. (2022). Cycloscope Reagent. https://www.cytognos.com/products/cyt-cs-r-50/
- Memorial Sloan Kettering Cancer Center. (2020, marzo 23). Proliferation in flow. https://cdn.fccf.aws.mskcc.org/20200323_Proliferation_in_Flow_b90b96f655.pdf
