La apoptosis se caracteriza por la pérdida de ciertas características morfológicas, que incluyen la pérdida de asimetría y adhesión de la membrana plasmática, la condensación del citoplasma y el núcleo, y la clivación internucleosomal del ADN. La pérdida de la membrana plasmática es una de las primeras características. En las células apoptóticas, el fosfolípido de membrana, la fosfatidilserina (PS), se transloca desde la membrana citoplasmática interna a la membrana externa, exponiendo así la PS al entorno celular externo. La anexina V es una proteína de unión a fosfolípidos dependiente de Ca2+ con un peso molecular de 35-36 kDa que tiene una alta afinidad por la PS y se une a células con PS expuesta. La anexina V puede conjugarse con fluorocromos, incluido el FITC. Este formato mantiene su alta afinidad por la PS y sirve como una sonda sensible para el análisis citométrico de flujo de células que están experimentando apoptosis. Dado que la externalización de la PS ocurre en las etapas tempranas de la apoptosis, la tinción con FITC Anexina V puede identificar la apoptosis en una etapa más temprana que los ensayos basados en cambios nucleares, como la fragmentación del ADN.
La tinción con FITC Annexin V precede a la pérdida de integridad de la membrana, la cual acompaña a las etapas finales de la muerte celular resultante de procesos apoptóticos o necróticos. Por lo tanto, la tinción con FITC Annexin V se utiliza típicamente en conjunto con un colorante vital como el yoduro de propidio (PI) o la 7-Amino-Actinomicina (7-AAD) para permitir que el investigador identifique células apoptóticas tempranas (PI negativo, FITC Annexin V positivo). Las células viables con membranas intactas excluyen el PI, mientras que las membranas de las células muertas y dañadas son permeables al PI. Por ejemplo, las células consideradas viables son FITC Annexin V y PI negativas; las células en apoptosis temprana son FITC Annexin V positivas y PI negativas; y las células en apoptosis tardía o ya muertas son tanto FITC Annexin V como PI positivas. Este ensayo no distingue entre células que han experimentado muerte apoptótica y aquellas que han muerto como resultado de una vía necrótica, porque en ambos casos, las células muertas se tiñen con FITC Annexin V y PI. Sin embargo, al medir la apoptosis a lo largo del tiempo, a menudo se pueden rastrear las células desde FITC Annexin V y PI negativas (viables, o sin apoptosis mensurable), hasta FITC Annexin V positivas y PI negativas (apoptosis temprana, con integridad de membrana presente) y finalmente a FITC Annexin V y PI positivas (etapa final de apoptosis y muerte). El movimiento de las células a través de estas tres etapas sugiere apoptosis. En contraste, una única observación que indique que las células son tanto FITC Annexin V como PI positivas, en sí misma, revela menos información sobre el proceso por el cual las células sufrieron su desaparición.
Referencia bibliográfica
